人偏肺病毒q-pcr檢測方法
人偏肺病毒的q-pcr檢測主要通過(guò)核酸提取、引物探針設計、擴增反應、結果分析和質(zhì)控驗證五個(gè)步驟完成。
1、核酸提?。?/h3>
采用磁珠法或離心柱法從呼吸道樣本中提取病毒RNA，樣本類(lèi)型包括鼻咽拭子、肺泡灌洗液等。提取過(guò)程需在生物安全柜內操作，防止氣溶膠污染，同時(shí)加入內參基因監控提取效率。提取后的RNA需立即逆轉錄或保存于零下80度環(huán)境。
2、引物探針：
針對病毒N基因或L基因保守區域設計特異性引物和TaqMan探針。引物長(cháng)度通常為18-22個(gè)堿基，Tm值控制在58-60度，探針5'端標記FAM熒光基團，3'端淬滅基團多選用BHQ1。需通過(guò)BLAST驗證序列特異性，避免與其他呼吸道病毒交叉反應。
3、擴增反應：
采用一步法RT-qPCR體系，包含逆轉錄酶、DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。反應程序設置為50度逆轉錄15分鐘，95度預變性3分鐘后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的95度15秒、60度1分鐘兩步擴增。每批檢測需設置陽(yáng)性對照、陰性對照和空白對照。
4、結果分析：
根據擴增曲線(xiàn)Ct值判定結果，通常Ct值≤37為陽(yáng)性，37-40需重復檢測，＞40為陰性。采用標準品制作標準曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，擴增效率應保持在90-110%之間。需注意曲線(xiàn)形態(tài)判斷，排除非特異性擴增或抑制現象。
5、質(zhì)控驗證：
實(shí)驗室需定期參加室間質(zhì)評，每批次檢測需監控內參基因Ct值穩定性。提取環(huán)節加入過(guò)程控制品，擴增體系加入內標檢測抑制物。陽(yáng)性樣本建議進(jìn)行基因測序驗證，新引物探針需通過(guò)靈敏度與特異性驗證，檢測下限需達到100拷貝/毫升。
檢測前24小時(shí)避免劇烈運動(dòng)及高脂飲食，采樣時(shí)使用無(wú)菌聚酯纖維拭子深入鼻咽部旋轉停留10秒，采樣后2小時(shí)內送檢。實(shí)驗室應分區操作避免污染，定期校準熒光定量PCR儀，操作人員需穿戴防護裝備。冬季流行季節可增加檢測頻次，免疫功能低下者出現陰性結果時(shí)建議復測或聯(lián)合血清學(xué)檢查。
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