雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)原理
雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的原理是基于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下與銅離子形成紫色絡(luò )合物。該反應主要涉及雙縮脲試劑中的氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉三種成分協(xié)同作用。
1、堿性環(huán)境：
氫氧化鈉提供強堿性環(huán)境，使蛋白質(zhì)分子中的肽鍵暴露并解離出氫離子，形成帶負電的肽鍵結構。堿性條件還能維持銅離子穩定存在，避免其形成氫氧化銅沉淀。
2、銅離子絡(luò )合：
硫酸銅解離出的二價(jià)銅離子與肽鍵中的氮原子和羰基氧原子配位，形成四配位的紫色絡(luò )合物。每個(gè)銅離子可同時(shí)與4-6個(gè)肽鍵結合，絡(luò )合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
3、穩定劑作用：
酒石酸鉀鈉作為銅離子絡(luò )合劑，防止堿性環(huán)境下銅離子沉淀。其羧酸根與銅離子形成可溶性復合物，確保銅離子均勻分散于溶液中，提高檢測靈敏度。
4、肽鍵特異性：
反應特異性依賴(lài)于蛋白質(zhì)特有的多肽鏈結構。游離氨基酸或二肽因缺乏足夠肽鍵數量不顯色，三肽以上才能產(chǎn)生可見(jiàn)顏色變化，故該法對蛋白質(zhì)具有高度選擇性。
5、干擾因素：
銨鹽類(lèi)物質(zhì)會(huì )與銅離子競爭結合產(chǎn)生假陽(yáng)性，需提前透析去除。某些含硫化合物可能還原銅離子導致假陰性，檢測前應避免使用β-巰基乙醇等還原劑。
實(shí)際操作時(shí)需將待測液與雙縮脲試劑按1:1比例混合，室溫靜置10分鐘后觀(guān)察顯色。該方法適用于血清、組織勻漿等樣本的粗蛋白定量，檢測范圍通常為1-10毫克每毫升。注意比色前需充分混勻避免銅離子沉淀影響讀數，強堿性環(huán)境可能腐蝕比色皿，建議使用石英材質(zhì)容器。
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